【試験概要】細胞を播種した翌日、培養液を抽出液に代えて1週間培養後、形成コロニー数を数える。抽出液中に細胞毒性作用を示す溶出物が存在する場合、陰性対照群のコロニー数を100％として、抽出液処理群の相対コロニー形成率を求めると抽出液濃度（％）に依存してコロニー数が減少する。結果から、相対コロニー形成率が50％となる抽出液濃度（IC50）を求めることで細胞毒性作用を評価する。陽性の対照材料のIC50と比較する。

【試験期間】1.5か月　　【費用】約35万円

その４　寒天重曹法

【試験概要】多数播種した細胞の上に寒天を重層し、その上に試験材料もしくは抽出溶液をしみこませたろ紙を置く。試験材料、ろ紙から溶出した物質が、寒天の下にある細胞に到達して、細胞傷害を引き起こす程度を評価する。

【試験期間】1.5か月　　【費用】約35万円

溶出物試験ー発熱性物質試験

【試験概要】生理食塩水を用いて披験物質から抽出した生理食塩液抽出液を10ml/kgの容量でウサギ耳介静脈内に投与し、3時間にわたり連続的に直腸体温を測定する。投与直前の体温（対照体温）と30分毎の体温との差を求め最大体温上昇値を最終的な体温上昇とする。

第1回目　ウサギ3匹（6匹：GLP）を用い、体温上昇が0.6℃以上のウサギが2匹以上のときに発熱性物質陽性と判断する。体温上昇が0.6℃以上のウサギが1匹、または3匹の体温上昇の合計が1.4℃以上の場合には、再度試験を実施する。
第2回目　5匹のウサギの体温上昇が0.6℃以上が2匹以上のとき発熱性物質陽性と判断。
GLP準拠の際エンドトキシン試験（２か月　45万円）を行う場合がある。

【試験期間】約1か月　　【費用】約60万円

溶出物試験ー皮内反応試験

【試験概要】ウサギ3匹（GLP:6匹）を使用し、被験物質またはその抽出液を背部被毛を剪毛した皮内に、被験物質あるいは抽出液と、対照液をそれぞれ5か所ずつ投与して組織反応性を調べる。24時間後、48時間後、72時間後に皮膚反応の評点で肉眼的観察を行う。

皮膚反応評点
1)紅斑及び痂皮の形成
紅斑なし　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　0
かろうじて認識できる軽度な紅斑　　　　　　　　　　　　　　 　　1
はっきりした紅斑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　2
中等度ないし高度紅斑　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3
高度紅斑からわずかな痂皮の形成（深部損傷も含む） 　　　　　　　4
2)浮腫
浮腫なし　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0
かろうじて認識できる軽度な浮腫　　　　　　　　　　　　　　　　 1
膨隆による明確な縁が識別できる軽度な浮腫　　　　　　　　　　　 2
中等度浮腫　約1mmの膨隆　　　　　　　　　　　　　　　　　　  3
高度浮腫　1mm以上の膨隆と暴露範囲を超えた広がり　　　　　　  4

【試験期間】1か月　　【費用】約40万円

溶出物試験ー急性毒性試験

【試験概要】ラット、マウスの1群を5匹とし被験物質投与群4群、対照群1群→計5群。生理食塩水抽出液は静脈投与、植物油抽出液は腹腔内投与。投与容量は0.5ml/10g。投与直後、4、24、48、72時間後に評価表を使う。期間終了後、全例を剖検、死亡例は剖検実施。

評価表
　正常　　　　　副作用が認められない
　軽度　　　　　軽度の運動機能の低下、呼吸困難、腹腔刺激性の症状あり
　中程度　　　　運動機能低下、呼吸困難、腹腔刺激性、眼瞼下垂、下痢
　著しい　　　　虚脱、チアノーゼ、振せんあるいは重度の腹腔刺激性、下痢、眼瞼下垂
　死亡　　　　　死亡

【試験期間】1か月　　【費用】ラット　 雌雄同数　100万円
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 雌　　　　80万円
　　　　　　　　　　　　　　 マウス　　雌雄同数　60万円
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 雌　　　　55万円

溶出物試験ー溶出性試験

【試験概要】被験物質または溶出液、陰性対照液（生理食塩水）、陽性対照液（蒸留水）にウサギの脱線維血を添加し、37℃±1℃で1、2、4時間インキュベート後、遠心分離して各溶液の上清（核時間あたり3ｎ）を測定に使用。被験物質または抽出液の吸収スペクトルを測定。酸素化ヘモグロビンの吸収波形が見られる場合は、各溶液について、540nmまたは576nmにおける吸光度を測定。酸素化ヘモグロビン吸光波形画見られない場合は、各溶液上清にDrabkin試液を加えシアンアンメトヘモグロビンを生成させて540nmにおける吸光度を測定する。各時間毎に3ｎの平均を求め、その値から溶血率を算出し、評価表で確定する。

評価表
溶血率2％、もしくは少ない（負の場合は0％）　　　　　　　　 非溶血
2％＜溶血率≦10％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　軽度の溶血性
10％＜溶血率≦20％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 中等度の溶血性
20％＜溶血率≦40％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 強い溶血性
40％＜溶血率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 非常に強い溶血性

【試験期間】1か月　　【費用】約50万円−非GLP

溶出物試験ー皮膚感作性試験

【試験概要】モルモット（Hartley系・雌）を用い、1群を5匹。被験物質投与群、陰性対照群、陽性対照群の3群。一次感作は蒸留水＋FCA、被験物質溶液、被験物質溶液＋FCAを0.1ml/siteに皮内投与。1週間後、２次感作としてラウリル硫酸ナトリウム（SLS）塗布し、被験物質溶液0.2mlを含むろ紙を貼付する。48時間閉塞後貼付物除去。２週間後、６濃度の被験物質溶液0.1mlを含むろ紙貼付。24時間閉塞後、貼付物除去。惹起後46、72時間に、血管拡張に起因した紅斑、血管の透過性亢進に起因した浮腫の2指標にもとづいて判定。

【試験期間】２か月　　【費用】１5０万円

その他理化学的試験

溶出物試験

被験物質を蒸留水に浸漬して、121℃で１時間、100℃で30分間、70℃で24時間など、材質に応じた溶出を行う。得られた液を紫外線吸収スペクトルや蒸留残留物、過マンガン酸カリウム還元性物質などの検査項目について調べる。

代謝産物の同定・定量

薬剤を投与した後、尿や血液中などに代謝された潜在的な物質分析には、同定、定量、生物学的適合性の評価のための試験法があり、特性の試験として、質量分析（GC-MS、LC-MSなど）、NMR、LC、FTIRなどの試験法が用いられる。定量的な手法には、非揮発性残留物（NVR）の測定が含まれ、全有機炭素（TOC）の測定も有用な定量的測定法のひとつ。
【検査期間】　10サンプルまで　約1か月、10サンプル以上は1か月以上

【費用】　依頼時の条件提示により変動。サンプルが同質である場合と、サンプルすべてが異種物質である場合でも基本費用が変わる。NMR、LC/MS、HPLCなど使用機種によっても費用面で差が出る。
目安：基準1サンプル13万円とする。

細胞増殖(抑制)試験

細胞賦活、細胞増殖（抑制）を評価する。ヒト正常表皮細胞，ヒト正常線維芽細胞、マウス正常骨芽細胞，リンパ系癌：HL-60，APL，JLK　胃（胃腺）癌などを用いる。
【期間】1か月　　【費用】45万円＋細胞料金

抗酸化ストレス試験

UVA/B 抗酸化、光毒性　LPO（過酸化脂質量）の測定、8-OHdG の測定、SOD の測定。
ヒト正常線維芽細胞、ヒト正常線維芽細胞などを用いる。
【期間】1か月　　【費用】45万円+細胞料金

LDL抗酸化試験

酸化 LDL 量の測定
【期間】1か月　　【費用】40万円

炎症・アレルギー・酵素活性試験

COX の阻害活性　COX-1，COX-2 の測定、ヒスタミン遊離抑制活性、ヒスタミン遊離量の定量についてマウスマスト細胞を用いて評価する。
【期間】1か月　　【費用】50万円

皮膚試験

皮膚試験（美白）、コラーゲン産生促進、メラニン合成抑制、経皮吸収性、I 型コラーゲン量の測定、メラニン量の測定をヒト正常線維芽細胞、マウス B16 細胞を用いて行う。
【期間】1.5か月　　【費用】50万円

骨代謝試験

骨芽細胞分化促進　破骨細胞形成阻害
ALP 活性をアリザリンレッドを使用して破骨細胞数計測を行う。マウス正常骨芽細胞、マウス MT3T3-E1、マウス骨髄細胞などを用いる。
【期間】2か月　　【費用】45万円＋細胞料金

NOS阻害試験(NO生成阻害)

亜硝酸量の比色定量を動物細胞を用いて行う。
【期間】1か月　　【費用】50万円

筋肉細胞試験、筋肉細胞賦活試験

タンパク、遺伝子レベルでの解析をラット筋芽細胞を用いて解析。
【期間】1か月　　【費用】50万円

筋分化試験

タンパク、遺伝子レベルでの解析をC2C12細胞、L6細胞を用いて行う。
【期間】1か月　　【費用】50万円＋細胞料金

毛髪再生試験

育毛促進試験、WST-1、遺伝子レベルの解析、毛乳頭細胞を用いて行う。
【期間】2か月　　【費用】50万円＋細胞料金

肝機能試験

薬物代謝試験 CYP3A4、アルブミン産生をヒト初代肝細胞、HepG2を用いて評価する。
【期間】2か月　　【費用】60万円＋細胞料金

血管機能試験、内皮細胞試験

細胞増殖、タンパク・遺伝子レベルの解析をHUVEC、HAoECを用いて行う。
【期間】1か月　　【費用】50万円＋細胞料金

皮膚三次元モデルを用いた試験

皮膚刺激性試験、皮膚腐食性試験、紫外線吸収効果試験、サンスクリーン成分塗布によるp53発現抑制、表皮モデルでの乾燥度試験（最長3週間）、遺伝子発現解析、細胞感染試験、美白・炎症性効果試験、組織化学（パラフィン・凍結切片作製）、細菌感染試験、経表皮水分蒸散量試験、塗布成分暴露量試験、皮膚薬物動態試験
○Vitrolife-Skin（グンゼ） ○TESTSKIN（東洋紡） ○EpiDerm（クラボウ）
【期間】1.5か月　　【費用】試験1サンプル40万円＋キット代金＋細胞料金

コラーゲン合成評価試験

真皮の線維芽細胞の粗面小胞体上で、プロコラーゲンmRNAから合成されたプロコラーゲン分子は3本のらせん構造形成。細胞外分泌のプロコラーゲン分子は、N末端、C末端がプロテアーゼ により加水分解されコラーゲン分子は規則正しく架橋しコラーゲン線維となる。
�T型コラーゲンは、皮膚真皮の細胞外マトリックス成分の大部分を占める。α1鎖（�T型）2本とα2鎖（�T型）1本が集まって形成される。
�W型コラーゲンは、真皮と表皮の境目にある基底膜に多く含まれている。平面的な網目状のネットワークを形成し、基底膜の構造を支えていると考えられる。
�Z型コラーゲンは、ループ様の構造で基底膜に接着し、�T型コラーゲンをループ構造の中に保持して真皮マトリックス構造を維持する。

●プロコラーゲン分子合成の鋳型となるmRNA発現量に対する促進作用をReverse　transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）を用いて評価。
●コラーゲン蛋白合成量に対する作用を、線維芽細胞の培養上清中に分泌されたコラーゲン量を指標にEnzyme-linked immunosorbent assay（ELISA、酵素結合免疫測定法)で評価。
●正常ヒト真皮線維芽細胞あるいは正常ヒト表皮基底細胞の ヒアルロン酸産生に対する作用を評価(皮膚の水分保持能および弾力性を評価)。
●真皮では�T型コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸が細胞外マトリックスを形成、線維芽細胞産生酵素により分解される。�T型コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテアーゼ-1（Matrix mettaloproteinase-1, MMP-1)は少量の紫外線でタンパク量が増加し活性が亢進する。日常的な紫外線が皮膚に大きく影響する。MMP-1タンパク合成を阻害、酵素活性抑制成分は真皮の�T型コラーゲンの分解を抑制し、抗老化有効成分として展開する。
MMP-1のタンパク合成に対する抑制作用を抗ヒトMMP-1抗体を用いたWestern blotting法で評価。MMP-1の酵素活性に対する直接的な阻害作用を、蛍光標識したヒト由来�T型コラーゲンを基質とした酵素反応系で評価。

皮膚表面観察

皮膚の状態をテープストリッピング角層の状態で解析。評価のパラメーターとして角層細胞面積、剥離状態、有核細胞率、遊離のSH基。角層細胞の面積により表皮ターンオーバー速度を角層細胞の剥離状態、有核細胞率、SH染色から角化の状態を評価。

皮膚浸透・透過試験

皮膚浸透性、あるいは透過性を人工皮膚を用い、原料を浸透させた皮膚断面を顕微鏡で観察。皮膚を通過した物質をLC-MS-MSで定量評価する。

変容試験

成分分析の基準値からの異常値を確認し、状況・状態を分析評価する。

有害性分析

化粧品基準に対しての適合性を評価。混在する有害物質や発生物質を分析。

有機金属検出：カドミウム、ストロンチウム、セレン、ヒ素、鉛、クロム
防腐剤成分検出：安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸、トリクロイサン、メチルパラピン、プロピルパラピン、イソプロピルパラピン、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、フェノキシエタノール、クロルフェネシン
紫外線吸収成分：ｔ−ブチルフェノキシジベンゾイルメタン、オキシベンゾン、サリチル酸エチルへキシル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルへキシル、メトキシケイヒ酸エチルへキシル

防腐試験

大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑濃菌、黒カビ、酵母に対しての抗菌・制菌効果を測定し、原材料及び最終製品の防腐力を評価する。

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